VisuGait 動物步態(tài)分析系統(tǒng)是通過腳印光亮折射技術(shù)，采用高速攝像機采集移動中的大小鼠行走過程中的足印信息，然后利用我公司自主開發(fā)的足印步態(tài)分析系統(tǒng)自動識別分析小鼠的步態(tài)指標，以評價小鼠的運動和空間學習能力。評價指標包括：觸地面積、擺動速度、擺動時長、制動時長、步行周期、前后肢步寬、正常步序比等等，以此客觀評價PD模型的步態(tài)改變。

動物步態(tài)分析系統(tǒng)可用于評價神經(jīng)創(chuàng)傷、神經(jīng)性萎-縮、神經(jīng)疾病、以及疼痛癥狀群的動物模型。該系統(tǒng)應(yīng)用范圍包括：脊索損傷、神經(jīng)性疼痛、關(guān)節(jié)炎、中風、帕金森病、運動失調(diào)、腦損傷、外周神經(jīng)損傷等疾病的研究。通過步態(tài)分析，了解神經(jīng)源性疾病發(fā)展過程、評價治療方法的效果和篩選治療藥物。

帕金森氏癥導(dǎo)致肢體動作僵硬和協(xié)調(diào)性降低。步態(tài)分析系統(tǒng)通過測量動物模型中的腳間距離、擺動時相、支撐方式和正常步序比等參數(shù)評估運動協(xié)調(diào)性。

摘要

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是全-世-界-范圍內(nèi)第二大神經(jīng)退行性疾病，由于目前并未開發(fā)出前期的診斷方法，在病程中后期已無法根-治，臨床上多采用保守治療，藥物緩解癥狀和手術(shù)輔助治療。目前常用左旋多巴來彌補多巴胺能神經(jīng)元缺失所引起的多巴胺分泌不足，但是這種藥物緩解PD癥狀依賴于多巴脫羧酶的催化而發(fā)揮藥效，隨著晚期PD病人的神經(jīng)元缺失，這種酶也將減少，只能在早期發(fā)揮比較明顯的作用，加大藥量的同時也將產(chǎn)生更加明顯的副作用，除了增加肝腎負擔以外，還會引起不自主運動和精神錯亂等癥狀，因此，繼續(xù)探索PD的發(fā)病機制，尋找更加合適的藥物靶標挽救神經(jīng)元的缺失并探索合適的藥物仍然是探索的方向。

研究背景

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種神經(jīng)退行性疾?。∟eurodegenerative disease），具有不斷演變的復(fù)雜性。是以黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的嚴重缺失以及路易小體和神經(jīng)突觸內(nèi)含物的積累和擴散為主要病理標志的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。帕金森病被認為是繼阿爾茨海默病之后第二大的神經(jīng)退行性疾病，成為世界上患者增長速度最快的神經(jīng)退行性疾病，自1990年到2015年的25年間，病患人數(shù)增長已一倍，達到600多萬。隨著全球老齡化愈加嚴重，預(yù)計到2040年，病患人數(shù)將再增長一倍。PD的發(fā)病機制和病因至今尚未明確， 并沒有任何一種獨立學說能夠闡明其分子致病機制，已經(jīng)證明的分子機制包括氧化應(yīng)激下活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生、α-突觸核蛋白（α-synuclein）沉積、多巴胺（DA）合成減少或線粒體功能障礙等。主要影響運動神經(jīng)系統(tǒng)，臨床癥狀主要包括：1.運動癥狀：靜止性震顫、僵硬、步態(tài)異常等。2.睡眠障礙、認知障礙和抑郁等。

為此，探究 PD 致病機制，闡明神經(jīng)元缺失的分子機理或許是突破現(xiàn)有PD治療策略的重要方向。

實驗材料：

1.A53T轉(zhuǎn)基因小鼠或基因敲除小鼠（品系均為C57BL/6J）。

2.10%酒精用于擦拭步態(tài)玻璃板。

注：75%酒精氣味刺激性大，頻繁使用將導(dǎo)致小鼠不愿通過跑道。

3.衛(wèi)生紙。

4.空籠盒。

行為學測試步驟包括：

（1）VisuGait 動物步態(tài)分析系統(tǒng)軟件，該軟件從位于t臺跑道下方的攝像機接收信息，并檢測由于對跑道表面施加壓力(例如，通過放置爪子)而從跑道表面反射的光線。

（2）把老鼠放到t臺的一邊。

（3）通過簡單的按鈕點擊，以電子方式啟動系統(tǒng)。

（4）讓動物走到跑道的另一邊。

模型建立與藥物處理：

目前PD常用模型有神經(jīng)毒素模型和基因編輯模型，其中神經(jīng)毒素模型應(yīng)用更加廣泛。本課題兩種模型均有涉及，對PD模型A53T轉(zhuǎn)基因小鼠或基因敲除小鼠，使用小動物麻醉機對小鼠按推薦計量使用異氟烷進行麻醉后固定于腦立體定位儀上，通過顱骨鉆在小鼠顱骨上鉆孔，將顯微注射針植入鉆孔側(cè)大腦紋狀體區(qū)域后，使用 6-OHDA（8 mg/kg）對敲除小鼠紋狀體注射，聯(lián)同使用治療藥物21天。

動物生存環(huán)境：

將雌雄小鼠分開飼養(yǎng)每籠4-5只，分籠可避免發(fā)情和交配引起的激素水平改變，影響行為學的測試。室溫控制在22-25℃，12-12小時光暗循環(huán)的安靜環(huán)境中。給予充足的食物和飲用水。

Tip：實驗動物生存環(huán)境一定要安靜， 驚恐狀態(tài)下的小鼠，行為異常，不能反映真實行為學指標。每組小鼠最好不少于8只，以減少個體間差異，避免實驗偶然性。選擇12-14周齡小鼠，神經(jīng)退行性疾病小鼠隨著年齡增加，神經(jīng)元缺失更加嚴重，年齡太大，在病程后期，小鼠無法直立行走，年齡太小，表型不明顯，觀測不到運動異常指標。

提前適應(yīng)環(huán)境：將小鼠提前兩天放入測試環(huán)境空間飼養(yǎng)（最好是將設(shè)備放在飼養(yǎng)環(huán)境測試），更換環(huán)境后，小鼠因為空調(diào)出風口方向、光線照射位置、環(huán)境氣味等改變，而表現(xiàn)出焦慮情緒，而PD患者本身就存在非運動癥狀，環(huán)境可能影響實驗結(jié)果。

設(shè)備調(diào)試：步態(tài)利用的是腳印光亮折射技術(shù)，建議實驗者提前一天在實驗預(yù)計進行的同一時間段調(diào)試設(shè)備。

Tip：白天和夜晚的采光不同，通道的光線明暗對腳印識別至關(guān)重要，最初光調(diào)試設(shè)備就可能要花費幾個小時。其次是相機參數(shù)設(shè)置，在多數(shù)神經(jīng)退行性疾病模型中，需要分時間段進行行為學測試，進入步態(tài)軟件設(shè)置標尺需要用A4紙畫一個實體的標尺，在課題進行過程中，最好使用同一標尺，也不要改變軟件中方框的大小，因為軟件是通過等比例計算擺動距離、步長、前后肢間距等長度相關(guān)指數(shù)，只有在同一標尺下，不同時間段的指標才有比較的意義。

測試前訓(xùn)練：步態(tài)分析的測試前訓(xùn)練是必要的，將實驗鼠放入步態(tài)跑道上，第一次上跑道可將同籠鼠一起放入跑道5-10分鐘，保持安靜環(huán)境下，不進行測試，當老鼠通過通道，它會記住有一個出口可以回到籠子里和同伴待在一起，這將會是老鼠真正通過通道的動機。然后分別將實驗小鼠放入跑道一端，將另一端用擋板封堵，在電腦前等待小鼠進入錄像區(qū)域開始記錄。

Tip：測試開始時，實驗小鼠并不能很好適應(yīng)環(huán)境，在驚恐狀態(tài)下不會馬上通過通道，切勿驅(qū)趕、恐嚇方式促使小鼠通過跑道，一只老鼠幾乎不會停留在玻璃板上超過20分鐘不動，可能測試兩三百只才回出現(xiàn)一次。在陌生環(huán)境中食物引誘的方法也不可取。在一個新的環(huán)境中，老鼠甚至不愿意嘗試這種方法，因為這可能讓他們覺得會威脅到健康。老鼠是全-球-最-成功的物種之一，它們非常聰明，通常會避免嘗試任何新事物，除非是為了獲益而承擔風險。通過限制飼養(yǎng)糧食的量，每次通過通道后，通過獎勵小食物顆粒來刺激動物穿過人行道，也有研究者這樣操作。絕大多數(shù)(>95%)的小鼠在經(jīng)過1-2周的訓(xùn)練后（動物被要求在每天12克的食物限制下每天跑2次），就能夠迅速地連續(xù)跑過步態(tài)設(shè)備的玻璃板。這可能是小鼠天生的探索天性所使然。特別注意介紹步態(tài)相關(guān)文獻中都強調(diào)了小鼠是在自愿狀態(tài)下通過通道，記錄真實的步態(tài)的。

在自然界中老鼠作為獵物，主要生活在地下，遠離光線的環(huán)境中，老鼠是典型的膽小動物，任何外界施加的壓力都有可能擾亂研究結(jié)果。強烈建議，在進行任何行為測試，實驗者可以多花點時間接觸自己的小鼠，以便它們熟悉人類接觸。在隨后的行為測試中，習慣于被研究人員拿起，突然被拿起來比安靜待在籠子里的老鼠焦慮得多。當然，不建議實驗者抓著老鼠的尾巴將它提起，這是老鼠最敏感的部位之一。在籠子里觀察到實驗小鼠的任何與焦慮相關(guān)的行為（打架、理發(fā)、過度梳理）也很重要，并在必要時采取措施進行干預(yù)。如果觀察到打斗，可以將發(fā)起攻擊的老鼠隔離并移出籠子。

不要俯視老鼠，不管你從哪個角度看著老鼠，它都會誤以為是捕獵者，不要嘗試推它或者恐嚇它讓它往前走，這會使它更不愿意行走。相反，如果你將它放在通道上，不被人注意到，在比較封閉的步態(tài)系統(tǒng)中它將會自由行走。

在一個新的環(huán)境中，老鼠甚至不愿意嘗試這種方法，因為這可能會威脅到它們的健康。請記住，老鼠是全-球-最-成功的物種之一，它們非常聰明，他們通常會避免嘗試任何新事物，除非他們能承擔風險，并能從結(jié)果中獲益。

在進行正式的行為學測試之前，研究者必須要熟悉設(shè)備和軟件，VisuGait 動物步態(tài)分析系統(tǒng)使用起來非常直觀和簡便。只需要多進行幾次測試，確保在正式測試時能夠熟悉操作儀器和軟件。

用擋板擋住通道回到小鼠籠的出口，將實驗小鼠放置在通道入口，回到電腦前等待小鼠通過相機測試區(qū)域，不要嘗試反復(fù)將小鼠放在同一位置開始，然后通過通道后又拿回起點，這樣反復(fù)操作，小鼠會誤以為自己的行為是錯誤的，導(dǎo)致它更長時間的停留。只需要將小鼠放置在入口，然后等待小鼠在玻璃板上來回行走時做好記錄即可。記錄數(shù)據(jù)時，在讓軟件上有“從右至左”和“從左至右”的選擇，小鼠將在通道上來回行走，建議每只小鼠測5次以上，保證有清晰記錄的圖像記錄。收集每只老鼠的多次連續(xù)的行走，并對這些行走進行平均分析，這可以減少實驗誤差。讓每個實驗老鼠多跑三次只需要多花幾分鐘，但是這對準確了解實驗小鼠的總體步態(tài)有很大的幫助。

測試過程中，實驗鼠隨時會有大小便，使用10%酒精擦拭玻璃板，并迅速擦干，避免糞便污漬影響實驗。老鼠是嗅覺十分敏感的動物，在行為學測試過程中，老鼠發(fā)現(xiàn)擋板和玻璃板上有其他不熟悉的味道，都會導(dǎo)致老鼠停止前進，分散注意力。

Tip：開始的前幾只小鼠，需要立即進行步行分析，查看行為學測試結(jié)果有幾十個指標被檢測，通過傳統(tǒng)的一次測試用一個表格導(dǎo)出數(shù)據(jù)不方便統(tǒng)計，通過與步態(tài)售后工程師溝通，開發(fā)了將一次實驗所有檢測指標匯總成同一表格內(nèi)進行統(tǒng)計，大大簡潔了統(tǒng)計過程。進圖、壓力圖、步序圖等參數(shù)是否可以正常記錄。

測試時間盡量保證在同一時間段進行，白天光照強，到夜晚可能需要重新調(diào)整通道的兩種LED燈亮度，重新檢查各項參數(shù)是否正常，將增加不必要的時間成本。其次，老鼠的運動活躍程度可能與晝夜節(jié)律有關(guān)。

測試過程中盡量不要說話和產(chǎn)生噪音，特別是老鼠痛苦時發(fā)出的吱吱聲，最好是在有舒緩的背景音樂狀態(tài)下進行實驗。正常情況下，老鼠受到驚嚇和噪音都會導(dǎo)致實驗小鼠本能停止，在奔跑過程中老鼠會因為其他聲音暫時停止前進。

不同時間點檢測同一項目實驗鼠行為學參數(shù)，必須保證相機參數(shù)和標尺一致，才有可比性。

行為學測試結(jié)果有幾十個指標被檢測，通過傳統(tǒng)的一次測試用一個表格導(dǎo)出數(shù)據(jù)不方便統(tǒng)計，通過與步態(tài)售后工程師溝通，開發(fā)了將一次實驗所有檢測指標匯總成同一表格內(nèi)進行統(tǒng)計，大大簡潔了統(tǒng)計過程。

擺動時長（Swing Duration）：擺動時長會隨著速度的增加而減少，同時也有一個限度。關(guān)節(jié)炎動物可能會因為關(guān)節(jié)機動性的損失而使擺動時長增加。疼痛狀態(tài)下擺動時長會增加，較長的前肢擺動持續(xù)時間可以提供給小鼠充分的機會讓其在負載前進行臂肢放置。

擺動百分比（% Swing）: 假設(shè)整個步幅時長（Stride Duration）是*，那么X%是腳爪接觸（ stance）， Y%是非腳爪接觸（ swing）。X% stance+Y% swing=100% stride。典型的% swing大約為35%；此數(shù)值在加速狀態(tài)下會明顯增加。

步幅長度（Stride Length）：同一腳爪的連續(xù)步幅之間的距離，正常狀態(tài)下，給定動物的4個腳爪的此項數(shù)值幾乎相等。胎兒期和初生期給予酒精會導(dǎo)致步幅長度顯著地變短，當嚙齒動物行走速度提高，步幅長度也會提高，觸地時長會減少，有關(guān)節(jié)炎的小鼠同樣會有較短的步幅長度。

觸地寬度（Stance Width）：一般地，前肢的觸地寬度會小于后肢的觸地寬度，此距離和身體尺寸有依賴性。更大或者更小的數(shù)值可能指示為穩(wěn)定性而進行的姿勢調(diào)整。人類會因為較少穩(wěn)定而避免狹窄的腳步寬度。觸地寬度有時候被稱為“支撐基礎(chǔ)”。

腳爪面積（Paw Area）：腳爪面積可以指示足底放置范圍作為神經(jīng)損傷、體肢負載能力和疼痛程度的依據(jù)。例如，有慢性疼痛癥的大鼠表現(xiàn)出有前后腳爪面積的改變。在Huntington舞蹈病的轉(zhuǎn)基因模型上，后肢腳爪面積較小，但是在唐氏綜合癥模型上卻無變化。

步幅時長（Stride Duration）：小鼠在正常步行速度下的主導(dǎo)踏步模式是交替形式的，步幅時長取決于運動速度和步幅頻率。所有體肢的步幅時長通常情況下是基本相等的。